賽維爾生物服務、產品資料庫

賽維爾生物

TEL:400-6027-178

賽維爾生物

穩轉細胞系構建

  1. 首頁
  2. 全部分類
  3. 服務
  4. 細胞
  5. 穩轉細胞系構建
  6. 內容

穩轉細胞系構建

貨號:GC1036

品牌:Servicebio

價格:¥3000

規格:

附件下載地址: ×

一、實驗介紹

  穩轉細胞系構建,基于某一細胞系構建持續過表達或者干擾某特定基因的細胞系。

  外源基因在細胞中的表達可分為兩大類,一類是瞬時表達,一類是穩定表達(永久表達)。 前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,雖然可以達到高水平的表達,但通常只持續幾天。后者外源DNA整合到宿主細胞染色體上,使宿主細胞可長期表達目的基因。

  慢病毒是一種RNA病毒,攜帶的外源基因在病毒感染細胞后需要逆轉錄為DNA,再整合到宿主細胞基因組以后才能表達。利用慢病毒必須整合到宿主基因組的特性來篩選穩定株的方法克服了傳統方法的弊端,可以在短時間內獲得高效率的穩定細胞株。篩選得到的細胞或者可穩定表達目的蛋白,用于蛋白的擴增和富集;或者得到穩定沉默特定基因的細胞株。

  慢病毒幾乎可以感染所有種類的細胞,并且在感染后可以整合到受感染細胞的基因組,進行長時間穩定表達。
 

二、實驗流程

  1、細胞培養:細胞復蘇、傳代、凍存

  2、目的細胞藥物篩選濃度確定-通過梯度實驗

  使用不同濃度的抗生素對細胞進行處理,篩選出在5-10天內使細胞全部死亡的最低抗生素濃度來進行下一步的篩選試驗。不同的細胞對于同一種抗生素,其篩選濃度不同,而同一種細胞對于不同的抗生素,其最佳使用濃度也不同。所以在進行穩轉株篩選之前,一定要先進行藥物濃度篩選預實驗以確定最佳藥物篩選濃度。

  3、慢病毒侵染目的細胞

  根據公式計算病毒用量 (細胞數×MOI值/病毒原液滴度)×103=病毒用量(μL)

  4、抗生素篩選細胞左右,使得穩定表達的細胞得以保留。

  5、慢病毒穩轉株檢測,通過qPCR或者Western Blot檢測目的基因

  需要注意的是,mRNA的表達水平可能和蛋白的表達水平不一致,如果需要進一步研究蛋白的功能,可以使用WB檢測蛋白的表達水平。
 

三、客戶提供信息

  1、目的細胞名稱及培養條件;

  2、實驗目的:過表達或敲低;

  3、慢病毒熒光、抗性、滴度等信息。
 

四、樣本保存運輸

  1.活細胞:不透氣方瓶;

  2. 凍存細胞:純干冰件,保證干冰充足;

  3. 慢病毒:-80℃ 純干冰。
 

五、交付結果

  實驗報告,熒光照片,驗證結果。
 

六、結果展示



實驗器材展示:
 

Nikon熒光顯微鏡

生物安全柜

上一篇:返回列表

下一篇:返回列表

上海十一选五走势图下载